Mutacje w TUBB8 i Meiotic Aresztowanie ludzkiego Oocyte czesc 4

Jest to niezwykłe, ponieważ istnieje tylko u naczelnych. Postawiliśmy hipotezę, że u naczelnych, TUBB8 wpływa na zachowanie mikrotubul w oocytach, w których samoorganizacja mikrotubul i białek motorycznych kieruje zespołem mejotycznego wrzeciona i orientacją chromosomu.18,19 Uderzająco odkryliśmy, że TUBB8 jest jedynym izotypem .-tubuliny wyrażanym w wysoki poziom na różnych etapach rozwoju ludzkiego oocytu i jest zasadniczo nieobecny w dojrzałych plemnikach oraz w tkankach somatycznych, takich jak mózg i wątroba (ryc. S4 w dodatkowym dodatku). Immunobarwienie ludzkich oocytów na różnych etapach rozwoju przy użyciu pozornie swoistego przeciwciała anty-TUBB8 – lub przeciwciała anty-FLAG, w przypadku ludzkiego oocytu pęcherzyka płciowego, poddanego mikroiniekcji z komplementarnym RNA TUBB8-FLAG, potwierdziło, że TUBB8 rzeczywiście jest zlokalizowane na wrzecionie (Rys. Implikacje strukturalne
Zmapowaliśmy zmutowane reszty TUBB8 na strukturze atomowej tubuliny (Protein Data Bank [PDB] code 3JAS) .20 S176 znajduje się na podłużnej granicy między złożonymi dimerami, gdzie oddziałuje z .-tubuliną (ryc. S6A w dodatku uzupełniającym ) i leży w kluczowym regionie (V177-S178-D179) w pętli .-T5, która zmienia hydrolizę guanozyno-trifosforanową (GTP). 20,21 Jest prawdopodobne, że mutacja S176L zakłóca podłużne interakcje, hamując w ten sposób montaż mikrotubuli. M363 może wchodzić w interakcję z V288 w regionie pętli M białka (Fig. S6B w dodatkowym dodatku); mutacja M363T mogłaby potencjalnie osłabić interakcję z V288 i tym samym spowodować niestabilność mikrotubuli.22 D417 i R262 oddziałują, tworząc mostek solny na zewnętrznej powierzchni mikrotubuli (Rys. S6C w Dodatku Uzupełniającym); ten most zostałby złamany przez mutacje D417N i R262Q. D417 bierze udział w wiązaniu kinezyn, 23, a jego mutacja prawdopodobnie wpłynie negatywnie na interakcję między mikrotubulami i kinezyną i prawdopodobnie innymi białkami związanymi z mikrotubulami. M300 i V229 są pochowane w podjednostce .-tubuliny, a ich mutacja może zdestabilizować jej fałdowanie (ryc. S6B w dodatku uzupełniającym). Na koniec R2 znajduje się na granicy faz .-. w obrębie heterodimeru (ryc. S6A w dodatkowym dodatku); jego podstawienie może wpłynąć na montaż dimeru i stabilność.
Zespół Heterodimer . / .-Tubuliny in vitro
Generacja de novo heterodimerów tubuliny wymaga skoordynowanego działania spektrum chaperonów: prefoldyny (PFD), zależnej od ATP chaperoniny cytozolowej (CCT) i pięciu chaperonów specyficznych dla tubuliny (TBCA, TBCB, TBCC, TBCD i TBCE) ta funkcja działa w połączeniu w dół od CCT jako nanomaszyna zespołu heterodimerowego zależnego od GTP. [24] Aby zbadać potencjalne defekty fałdowania powstałe w wyniku mutacji, monitorowaliśmy kinetyczne kinetyczne kinetydy TUBB8 znakowane 35S dzikiego typu i zmutowane. Żadna z mutacji nie miała żadnego wpływu na efektywność translacyjną (ryc. S7A w Dodatku Uzupełniającym). Jednakże zmutowane białka TUBB8 wykazywały spektrum ilościowych różnic w charakterystycznym przepływie znacznika z kompleksów binarnych PFD-.-tubuliny i CCT-.-tubuliny do TBCA-.-tubuliny i TBCD-.-tubuliny, w porównaniu z kontrola typu dzikiego (ryc
[podobne: cena rezonansu magnetycznego, zrosty opłucnowe, przychodnia aksamitna rejestracja ]