Mutacje w TUBB8 i Meiotic Aresztowanie ludzkiego Oocyte ad 6

Wnioskujemy, że ekspresja in vivo zmutowanego TUBB8 powoduje rozerwanie struktury mikrotubuli, z poziomem zakłócenia zależnego od mutacji, i że zakłócenie jest silnie uzależnione od kontekstu izotypu .-tubuliny. Aby ocenić zdolność mutacji TUBB8 do zakłócania dynamiki mikrotubul, zbadaliśmy konsekwencje osadzenia ich w TUB2 w Saccharomyces cerevisiae (ryc. S9 w Dodatku Uzupełniającym). Otrzymaliśmy szczepy diploidalnych drożdży niosących każdą mutację w stanie heterozygotycznym, z wyjątkiem S176L. Stwierdziliśmy, że podobnie jak zarodniki drożdży niosących mutację D417N, 26 szczepów niosących mutację V229A lub mutację R262Q nie było żywych, obserwacja zgodna z zasadniczym zaburzeniem funkcji mikrotubuli (ryc. S10 w dodatkowym dodatku) . Haploidalne zarodniki niosące R2K, M300I i M363T były żywe, ale z różnym stopniem upośledzenia wzrostu.
W porównaniu ze szczepem kontrolnym, szczepy z mutacjami R262Q i D417N miały większą odporność na lek benomylowy destabilizujący mikrotubule, odzwierciedlając niezwykle stabilne mikrotubule in vivo. Odwrotnie, mutacje R2K, V229A, M300I i M363T wszystkie zmniejszyły oporność na benomyl, co sugeruje, że dominują one zdestabilizować mikrotubule in vivo (Fig. S11A i S11B w dodatkowym dodatku). Co więcej, w komórkach eksprymujących zielone fluorescencyjne białko-.-tubulina, astralne mikrotubule w heterozygotycznych komórkach V229A i R2K uległy depolimeryzacji prawie dwa razy szybciej, a częstotliwość ratunkowa (tj. Częstotliwość, z którą katastroficzna depolimeryzacja mikrotubul powraca do wzrostu mikrotubuli) została znacznie zmniejszona, jak to opisano poniżej. w porównaniu z komórkami kontrolnymi (ryc. S11C w dodatkowym dodatku). Chociaż szybkości depolimeryzacji mikrotubul w komórkach R262Q były podobne do szybkości w komórkach kontrolnych, częstotliwość katastrofy (tj. Częstotliwość, z jaką rosnące mikrotubule nagle ulegają katastroficznej depolimeryzacji) i częstotliwość ratowania uległy zmniejszeniu, a czas spędzony na atenuowaniu (ani obkurczanie) został zwiększony (ryc. S11D w dodatku uzupełniającym).
Zespół TUBB8 i upośledzony wrzeciono
Ryc. 4. Ryc. 4. Zmutowane RNA TUBB8 w mysich i ludzkich oocytach.Panel A pokazuje prędkości wytłaczania w polarnym ciele w oocytach myszy, którym wstrzyknięto zmutowane RNA w porównaniu z dawkami kontrolnymi typu dzikiego. Wskaźniki, przedstawione jako średnia szybkości w trzech doświadczeniach, były znacząco zmniejszone u myszy ze zmutowanym RNA. T bary oznaczają standardowe odchylenia. Pojedyncza gwiazdka oznacza P <0,01, a podwójną gwiazdkę P <0,001, w porównaniu z oocytami typu dzikiego; Wartości P opierają się na niesparowanych t-testach. Panele B i C wykazują immunobarwienie mysich (Panel B) i ludzkich (Panel C) oocytów poddanych mikroiniekcji za pomocą RNA kodującego albo typu dzikiego albo zmutowanego (S176L lub D417N) TUBB8 12 godzin (mysz) i 16 godzin (człowieka) po pęcherzyku zarodkowym awaria. Oocyty MI wybarwiono Hoechst 33342 w celu wizualizacji chromosomów (niebieski), .-tubuliny do wizualizacji wrzecion (zielony) i FLAG do wizualizacji TUBB8 (czerwony).
Aby ustalić przyczynową zależność między mutacjami w TUBB8 i fenotypem niepłodności, przeprowadziliśmy mikroiniekcję dzikiego typu i zmutowanego RNA TUBB8 w oocytach myszy
[hasła pokrewne: magnesy ferrytowe, dentysta Lublin, oprogramowanie stomatologiczne ]