Mutacje w TUBB8 i Meiotic Aresztowanie ludzkiego Oocyte ad 5

Dane te ujawniają zakres defektów heterodimerycznych spowodowanych przez mutacje TUBB8. Niektóre z tych defektów można przypisać albo zmianom w równowadze, które rządzą zespołem de novo heterodimerów24, albo fałszowaniem; najbardziej prowadzą do zmniejszonej wydajności złożonych heterodimerów. Zakłócenie mikrotubulami w Vivo
Figura 3. Figura 3. Wpływ form dzikich i zmutowanych form TUBB8 na mikrotubule w komórkach HeLa Cells.HeLa transfekowano konstruktami zaprojektowanymi do ekspresji TUBB8 znakowanego FLAG-em (dziki i zmutowany). Panel A pokazuje wyniki immunobarwienia przeciwciałem wobec epitopu FLAG w celu wykrycia ekspresji transgenu (zielony) i barwienia immunologicznego przeciwciałem wobec .-tubuliny w celu wykrycia endogennej sieci mikrotubul (czerwony). Pokazano przykłady komórek eksprymujących różne transgenów, z mikrotubulami złożonymi w normalną lub nienormalną sieć międzyfazową lub z całkowitym zaniknięciem sieci mikrotubuli; w tych ostatnich komórkach etykieta FLAG pojawia się jako rozproszony, cętkowany wzór w całej cytoplazmie. Pasek wskazuje 10 .m. Panel B pokazuje ilościową analizę fenotypów mikrotubuli pokazaną w Tablicy A. Niska ekspresja zmutowanego TUBB8 była typowo związana z normalnym fenotypem, podczas gdy pośrednia i wysoka ekspresja zmutowanego TUBB8 była typowo związana z nieprawidłowymi i zanikniętymi fenotypami. Około 200 transfekowanych komórek eksprymujących TUBB8 typu dzikiego lub zmutowanych badano w każdym z trzech oddzielnych doświadczeń. Pokazano średnie wartości procentowe komórek przypisanych do każdej kategorii fenotypowej (normalna, nienormalna lub zanikła sieć mikrotubul); I słupki wskazują odchylenia standardowe.
Aby określić wpływ mutacji TUBB8 na zachowanie mikrotubul in vivo, transfekowaliśmy konstrukty znakowane FLAG do hodowanych komórek (HeLa). W przypadku TUBB8 typu dzikiego obserwowaliśmy łączenie w normalną sieć mikrotubul (Figura 3A), z wyjątkiem wysokiego poziomu ekspresji transgenu. Przeciwnie, zmutowany TUBB8, w pośrednich lub wysokich poziomach ekspresji, został włączony do mikrotubul o nieprawidłowym wyglądzie i często powodował całkowitą utratę sieci mikrotubuli ( obliteracja ). Fenotyp obliteracji był najsilniej związany z mutacjami przewidzianymi do zakłócania stabilności heterodimeru, fałdowania .-tubuliny lub polimeryzacji (V229A, S176L, M363T, R2K i M300I), podczas gdy zmieniona organizacja mikrotubuli była spowodowana przez mutacje, które według przewidywań mogą zakłócać wiązanie kinezyn (R262Q i D417N) (Figura 3B).
Powtórzyliśmy te eksperymenty ekspresji przy użyciu konstruktów, w których wprowadziliśmy trzy ze zidentyfikowanych mutacji TUBB8 do TUBB5 (zwanego także TUBB), izotypu .-tubuliny, który w przeciwieństwie do TUBB8 jest szeroko eksprymowany w tkankach ssaków, zwłaszcza w rozwijającym się ośrodkowym układzie nerwowym. 25 Stwierdziliśmy, że dzikiego typu TUBB5-FLAG niezmiennie włączano do normalnej sieci mikrotubul, podczas gdy ekspresja S176L, M363T i R262Q w kontekście TUBB5-FLAG powodowała szereg nieprawidłowych fenotypów mikrotubuli, które były podobne do obserwowanych równolegle eksperymenty przeprowadzone w kontekście TUBB8-FLAG, ale przy znacznie zmniejszonej częstotliwości (ryc
[hasła pokrewne: adhd test, ortodonta tarchomin, pląsawica huntingtona ]